Si l'on veut examiner une préparation biologique d'un indice de réfraction proche de celui de l'eau (n = 1,33) avec un objectif d'ouverture élevée, un objectif à immersion dans l'huile ne donne des résultats satisfaisants que lorsqu'on reste plus ou moins en surface. Si l'on essaie au contraire de mettre au point plus en profondeur, de fortes aberrations sphériques font baisser le contraste et la résolution et la luminosité s'en trouve considérablement réduite, ce qui se traduit notamment par un rapport signal-bruit bien plus faible en microscopie confocale. Un objectif à immersion dans l'huile n'est donc pas optimal pour l'observation de milieux semblables à l'eau, quelles que soient ses qualités par ailleurs. L'indice de réfraction de la préparation (et du milieu d'immersion) joue un rôle primordial dans le calcul des objectifs. En calculant la correction d'un objectif à immersion dans l'huile, on suppose que l'indice de réfraction du milieu d'immersion correspond à celui du milieu d'enrobage (n = 1,52). Pour le calcul des objectifs à immersion dans l'eau, on part d'un indice de réfraction de n = 1,33 pour les milieux d'immersion et d'enrobage. Les particularités de cette gamme d'objectifs : objectifs C-Apochromat 40x et 63x corrigés de l'ultraviolet jusqu'à l'infrarouge ! Autres objectifs à immersion dans l'eau :
Pour un emploi sans lamelle couvre-objet :
- Objectifs Achroplan W corrigés pour des examens sans lamelle couvre-objet, notamment pour la micro-injection et le procédé patch-clamp sur des microscopes droits.
- Objectif Plan-Apochromat W 63x/1.0 corrigé de la lumière visible jusqu'à l'infrarouge.
Pour un emploi avec lamelle couvre-objet :
- Objectifs à multi-immersion LCI Plan-Neofluar, appropriés pour les milieux d'immersion dont l'indice de réfraction est compris entre ceux de l'eau et de l'huile et corrigés pour une épaisseur de lame couvre-objet définie.
Si une préparation en solution acqueuse doit être soumise à un examen poussé, avec un microscope à balayage laser p. ex., il importe de satisfaire un certain nombre de besoins spécifiques :
- Ouverture élevée pour une haute résolution de coupes optiques fines et haute luminosité en fluorescence
- Grande distance de travail pour des examens en 3D
- Faible aberration chromatique longitudinale, afin que les plans focaux de différentes couleurs coïncident
- Faible chromatisme de grandeur, afin que différentes fluorescences coïncident dans l'image
- Champ plan, afin d'obtenir une reconstitution 3D fidèle
L'objectif C-Apochromat 40x/1,2W Korr a été conçu pour répondre à ces besoins, en présentant les caractéristiques suivantes :
- Immersion dans l'eau en présence de solutions acqueuses (coupes in vivo, cellules de culture, préparations dans un milieu acqueux)
- Bague de correction des différences d'épaisseur des lamelles couvre-objet (0,14...0,18 mm) et des différences de température (échelles pour 24°C et 37°C)
- La bague de correction peut servir également à compenser de faibles écarts d'indice de la préparation par rapport à l'indice de réfraction de l'eau
- Un grandissement de 40x
- Une ouverture numérique de 1,2
- Une libre distance de travail de 220 micromètres
- Une correction de la courbure d'un champ de 25 mm (conventionel) ou 12 mm (confocal)
- Transmission (absolue) : 50 % à 350 nm, 85 % à 400 nm, 90 % à 500...700 nm
- Bonne correction chromatique (correspondant à celle des objectifs Plan-Apochromat)
- Pas d'aberration sphérique avec des préparations acqueuses
Information de fond
Lorsque les indices de réfraction des milieux d'enrobage et d'immersion ne sont pas identiques, les longueurs optiques diffèrent. La différence qui en résulte peut être importante ou négligeable selon que la mise au point est faite plus ou moins en profondeur. Cela peut entraîner des aberrations sphériques considérables qui se traduisent par une netteté d'image, un contraste, une luminosité et une profondeur de champ nettement réduits. En plus, l'échelle n'est pas restituée correctement lors de mesures dans le sens axial, ce qui cause des compressions ou des allongements dans l'axe Z. Les indices de réfraction doivent donc correspondre pour éviter des déformations en Z. Une correction après coup à l'aide d'un ordinateur n'est qu'un palliatif, car une correction correcte des aberrations sphériques n'est pas possible. Il faut donc adapter l'immersion à la préparation. Or, les objectif d'une ouverture aussi élevée (1,2 constitue la limite supérieure pour l'eau) sont très sensibles en ce qui concerne les variations d'épaisseur des lamelles couvre-objet. C'est pourquoi ils possèdent une bague de correction qui permet une compensation pour des lamelles couvre-objet comprises entre 0,14 mm et 0,18 mm d'épaisseur. Pour assurer une performance optique optimale, il convient cependant d'utiliser des lamelles aux tolérances très serrées (0.16...0.17 p. ex.). Sur un microscope à balayage laser, l'épaisseur de la lamelle couvre-objet peut être mesurée simplement et la correction peut donc être réglée avec une haute précision.